細(xì)胞趨化實驗新方法：可實時觀察細(xì)胞動態(tài)

細(xì)胞趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指細(xì)胞、細(xì)菌及其他單細(xì)胞、多細(xì)胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運動。趨化性對細(xì)胞的發(fā)展和其他正常功能一樣*。

在這里，我們以小鼠樹突狀細(xì)胞為例，介紹一個細(xì)胞的化學(xué)趨化實驗。

一、實驗材料準(zhǔn)備：

1. 儀器：

• 細(xì)胞培養(yǎng)箱（高濕度，37℃，5%CO2）
• 倒置顯微鏡，具有10X相差物鏡和定時拍照功能
• 鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）
• 可選配置：全自動載物臺，自動對焦系統(tǒng)
• 分析軟件：可選用手動分析軟ImageJ的“Manual Tracking”模塊，或全自動的ibidi提供的WimTaxis進(jìn)行細(xì)胞軌跡追蹤。后使用ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1. 樹突狀細(xì)胞：

實驗前一天準(zhǔn)備工作：

為了減少ibidi細(xì)胞趨化載玻片與培養(yǎng)基中的氣泡，將載玻片和培養(yǎng)基提前24小時放入培養(yǎng)箱中

將8-10天的樹突狀細(xì)胞用200 ng/ml LPS 過一個晚上處理（培養(yǎng)基等試劑見表一）

表一：細(xì)胞培養(yǎng)和活化所需的試劑盒培養(yǎng)基

*Lutz, M. B. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods 223, 77–92 (1999)  

1. 基質(zhì)膠制備，Collagen I，bovine，1.6mg/ml

樹突狀細(xì)胞的化學(xué)趨化實驗所需的試劑如下：

                                         表二：化學(xué)趨化需要的耗材和試劑

表三：制備1.6mg/ml 基質(zhì)膠

操作步驟：
●使用表一中的培養(yǎng)基制備  9 x 106 cells/ml 的細(xì)胞懸液
●在1.5ml離心管中小心混勻表三中的1和2號試劑，避免產(chǎn)生氣泡
●在另一1.5ml離心管中準(zhǔn)備150 μl  collagen 
●使用200μl槍頭從第二步的混合液中吸取30μl（圖一A）
●小心混勻（圖一B），避免產(chǎn)生氣泡
●加入90μl細(xì)胞懸液到上一步混合液中（圖一C）
●小心混勻（圖一D），避免產(chǎn)生氣泡

圖一：制備細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液圖示，注意：1）避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會破壞膠原纖維，不能使用Vortex；2）膠原混合后，離膠凝大約有5分鐘時間，如果在凝膠后再進(jìn)行操作會破壞膠原纖維；3）當(dāng)剛加10x MEM到NaHCO3中的時候會看到顏色變化，這表明沒有充分反應(yīng)，因此加入混合液到膠原蛋白中后要充分混勻。

1. 細(xì)胞趨化實驗

1. 趨化試劑

• 化學(xué)趨化物：CCL 19（1.25 μg/ml in RPMI 1640/10%FCS）
• 無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基：RPMI1640，10%FCS

1. 實驗步驟

• 當(dāng)細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液制備好后直接加入ibidi細(xì)胞趨化載玻片的中間通道中（圖二）

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圖二，在觀測通道中加入細(xì)胞-基質(zhì)膠混合液

• 將細(xì)胞趨化載玻片放入培養(yǎng)箱中30-35分鐘，等待膠原蛋白凝固

膠凝固后，分別在兩邊儲液池中加入60μl的化學(xué)趨化物和無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為細(xì)胞趨化實驗（+/-）（圖三）

圖三：加入化學(xué)趨化物（紅色）和無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）

在兩邊儲液池中均加入60μl的無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基作為空白對照（-/-）（圖四

圖四：加入無化學(xué)趨化物培養(yǎng)基（藍(lán)色）作為空白對照

• 按說明，將通道加液孔塞緊后可以進(jìn)行圖像采集
• 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中，調(diào)整好采集位點，進(jìn)行4小時的觀測，每2分鐘采集一張圖片

圖五：明場1小時處圖像采集，由于是3D培養(yǎng)環(huán)境，不是所有的細(xì)胞都能被清楚的成像。

1. 圖像處理

1. 手動細(xì)胞軌跡追蹤

• 下載ImageJ，并安裝Manual Tracking模塊
• 導(dǎo)入采集的系列圖像到ImageJ中，打開模塊“Manual Tracking”，選擇“Add track”開始記錄細(xì)胞軌跡
• 選擇一個細(xì)胞，按照時間點單擊細(xì)胞，*點擊后，會有新窗口跳出來顯示初始位置，以后每次點擊，都將在這個新窗口中產(chǎn)生一個該細(xì)胞隨著時間的新坐標(biāo)
• 統(tǒng)計完足夠的細(xì)胞軌跡后，保存軌跡坐標(biāo)表格
• 至少收集30個細(xì)胞的軌跡才具有統(tǒng)計學(xué)意義，避免同一細(xì)胞追蹤兩次，去除由于凋亡會而不能采集完整的軌跡的細(xì)胞
• 可以將“Overlay dots & lines”以.avi格式導(dǎo)出

2）全自動細(xì)胞軌跡追蹤

使用ibidi的WimTaxis自動分析平臺，將采集的系列圖像上傳到該平臺，幾個工作日后，會得到細(xì)胞軌跡的坐標(biāo)表格數(shù)據(jù)結(jié)果。

四、數(shù)據(jù)處理

使用遷移指數(shù)（ Forward Migration Indices*，FMIs）作為比較趨化實驗和對照試驗的參數(shù)。在有趨化物的情況下，空白對照的FMI和與趨化物垂直方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)（FMI┴）應(yīng)是在0點左右。而與趨化物平行方向的化學(xué)趨化的遷移指數(shù)（FMI‖）與0點有顯著的區(qū)別表現(xiàn)出了化學(xué)趨向性。同時，使用Rayleigh Test**對細(xì)胞趨化的方向性進(jìn)行檢驗。如果p值大于0.05表示了細(xì)胞運動的無序性，表明沒有方向性的遷移。此外，遷移速率等參數(shù)也能直接用于分析。

*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  

**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993) 

五、統(tǒng)計結(jié)果：

六、實驗優(yōu)勢總結(jié)

1.可實時觀察細(xì)胞趨化情況；

2.可計算細(xì)胞的趨化速率；

3.在1組實驗中即可做出連續(xù)性趨化濃度梯度；

4.建立的濃度梯度可維持長達(dá)48小時，對快速遷移細(xì)胞或慢速遷移細(xì)胞都適用；

5.可選配套的圖像分析，輕松得到實驗數(shù)據(jù)。